Il protagonista di Assassin's Creed II è un nobile fiorentino antenato di Desmond Miles e discendente di Altair, di nome Ezio Auditore. L'avventura inizierà nell'anno 1486 che corrisponderà all'epoca del rinascimento e oltre ad essere dotato di due lame, il "nuovo Altair" non si è sottoposto al rito del taglio delle dita per permettere la fuoriuscita delle lame dai pugni, quindi le userà in maniera diversa da Altair. Nel corso dell'avventura è possibile vedere alcune delle location che ospiteranno questo nuovo episodio e sono: la Basilica di San Marco, il Canal Grande e il Ponte di Rialto, quest'ultimo all'epoca ancora in costruzione. Ma potremo visitare anche alcuni luoghi della campagna Toscana. Ezio Auditore si potrà spostare nei seguenti luoghi o a piedi o a cavallo, mentre a Venezia avrà la possibilità di nuotare nei canali e restare immerso finché il suo fiato glielo permetterà. Ci saranno nuovi metodi di gameplay che il protagonista potrà utilizzare come ad esempio uccidere un nemico silenziosamente (se, per esempio, un soldato vedrà qualcosa muoversi dentro un covone di fieno e si avvicinerà, Ezio potrà ucciderlo silenziosamente con una lama e mettere il cadavere dentro il covone in modo che non venga trovato) e potrà avere nuove armi a disposizione tra cui un'ascia, una mazza, un martello, una lancia, un paio di spade e due diversi tipi di piccole lame, tutte dotate di caratteristiche diverse. È stata implementata anche la funzione grazie alla quale sarà possibile sottrarre le armi al nemico ucciso, permettendo così una vasta gamma di scelta di armi. La giornata sarà divisa fra giorno e notte e avrà 16 missioni differenti fra di loro che scompariranno e compariranno a seconda della reputazione di Ezio, nel corso del gioco si incontreranno nuovi personaggi storici fra Machiavelli, Caterina Sforza e Lorenzo de Medici. Siccome è stato confermato il laboratorio di Leonardo da Vinci, vedremo questo personaggio insieme alla Gioconda. Si potranno utilizzare anche le sue invenzioni per planare da un tetto all'altro. Nei vari scenari si potranno trovare oggetti nascosti come emblemi, statue ed altro che andranno a sbloccare contenuti bonus. Inoltre, Ezio sarà più violento di Altair ed avrà un arsenale più vasto rispetto al primo episodio e i viaggi saranno meno lunghi e in questo nuovo episodio scopriremo nuovi dettagli sul frutto dell'eden e ci saranno sempre le lotte tra assassini e templari.